新工具破解活细胞非重复DNA序列成像难题

活细胞DNA成像是指利用成像手段，对活细胞内的DNA序列进行标记和观察。活细胞DNA成像常用于检测基因组DNA在细胞核内的定位分布和动态变化等特征，帮助人们了解这些特征与基因表达调控之间的关系，加深人们在基因组层面对细胞生命活动的认识。在医疗领域，活细胞DNA成像可以用来检测细胞内基因组DNA的拷贝数，有助于21-三体综合征等染色体异常相关疾病的诊断。

日前，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员陈玲玲团队开发了一种活细胞DNA成像新工具。团队筛选并优化了现有的基因编辑系统CRISPR-dCas12a，并基于此构建了新型DNA成像系统CRISPRdelight。这一新工具可用于活细胞内非重复DNA序列成像，为研究活细胞中DNA位点的空间位置和动力学特征提供了更加简单便利的手段。相关研究论文在线发表于《自然·方法》杂志。

已有工具存在明显局限

随着能够特异性靶向任意核酸序列的基因编辑系统CRISPR-Cas被开发出来，基于该系统的活细胞DNA成像工具也在不断迭代更新。

“当前，活细胞DNA成像工具的种类已经十分丰富。”论文第一作者、中国科学院分子细胞科学卓越创新中心博士杨良中介绍，其中大部分工具都是从CRISPR/dCas9-EGFP系统衍生而来。这些已有的活细胞DNA成像工具分别从向导RNA的骨架结构和表达质粒构建方式等方面，对原始系统进行优化升级。

例如上海科技大学研究员马涵慧开发了DNA成像系统CRISPRainbow和CRISPR-Sirius，用于在活细胞中观察基因组的三维结构，并示踪它们的动态变化。前者创造性地在向导RNA骨架结构中引入了RNA适配体，用于标记DNA序列，并通过改变RNA适配体的类别，实现了不同DNA靶点的多色成像。后者则在此基础上进一步做了优化，通过增加RNA适配体的数目来提高成像质量。北京大学教授陈匡时团队开发的两种DNA成像系统，则通过引入分子信标和荧光共振能量转移成像方法来提高DNA成像信噪比，以提升成像清晰度。

“目前较为成熟的系统已经实现了活细胞内绝大部分重复DNA序列成像和多色成像，甚至在一定程度上实现了非重复DNA序列成像，但它们都存在明显的局限性。”杨良中举例说，比如一些系统，通过改进向导RNA表达质粒的构建方式，将多条向导RNA表达元件放到同一个质粒上，从而减少需要向细胞内递送质粒的数目，增强成像效果。但将多个表达元件构建到一个质粒的方法步骤繁多、操作复杂，并不利于推广使用。还有一些系统，通过将DNA的标记信号放大，实现一条向导RNA对目的序列的标记和成像。但仅利用一条向导RNA可能会存在标记脱靶的问题。

总而言之，在基于CRISPR/dCas9-EGFP的活细胞DNA成像工具中，利用一条向导RNA标记DNA往往信号太弱或容易脱靶，要实现特异性非重复DNA序列成像或多色成像，需要表达多条向导RNA，通过多个靶点DNA信号的富集作用，才能实现对目的非重复序列成像。而如果让每个表达元件只表达一条向导RNA，就会增加向导RNA表达元件的数量，提高成像的复杂度，降低成像效率。“如何高效率、高质量实现非重复DNA序列成像，一直是活细胞DNA成像领域的一大挑战。” 杨良中说。

新型系统更加简便高效

与基于CRISPR/dCas9-EGFP的活细胞DNA成像工具不同，此次团队开发的新工具是基于基因编辑系统CRISPR-dCas12a。这两种系统都可以特异性靶向DNA，但CRISPR-dCas12a还能够加工处理系统本身的CRISPR阵列，并生成成熟的向导RNA。

“我们开发的新型DNA成像系统CRISPRdelight正是利用了这一特点，通过表达一条能编码多条向导RNA的转录本来进行成像，而非单独转录每条向导RNA。”杨良中介绍，这样既实现了对靶点DNA信号的富集放大，又避免了系统复杂度增加。而且这一条转录本不仅可以编码靶向同一DNA位点的向导RNA，也可以同时编码靶向不同位点的向导RNA，实现多位点多色成像。因此，新系统更加简便高效，容易通过增加向导RNA的数目提高成像质量，大大降低了活细胞中非重复序列DNA成像的门槛。

与此同时，团队利用新系统揭示了基因位点在细胞核内的定位与其运动能力和转录活性的相关性，还实现了对4种活细胞内卫星DNA的多位点多色成像。

由于新系统具有简便易操作等特点，杨良中认为，该系统未来有望应用于需要进行活细胞DNA成像的实验室，为活细胞中基因组DNA转录活性、DNA在细胞核内的定位分布和动态变化特征之间的关联性，以及等位基因之间表达调控的异质性等研究提供助力，还能进一步帮助研究人员了解三维基因组在细胞核内高度组织化的分子机制及其功能意义等。

非重复DNA序列成像和多位点多色成像是活细胞DNA成像长期面临的两大难题。如今，新系统的出现基本解决了非重复DNA序列成像的问题，但在活细胞DNA多位点多色成像方面，新系统仍有改进空间。“尽管我们通过在新系统中引入RNA适配体实现了多个重复DNA序列的多位点多色成像，但是RNA适配体的引入在一定程度上影响了系统对CRISPR阵列的加工能力。”杨良中说，要实现多个非重复DNA序列的标记追踪，未来还需进一步对CRISPRdelight进行优化。